4.2 Требования к химическим реактивам и приготовление растворов

"ГОСТ EN 15607-2015. Межгосударственный стандарт. Продукты пищевые. Определение D-биотина методом высокоэффективной жидкостной хроматографии" (введен в действие Приказом Росстандарта от 21.07.2015 N 949-ст)

4.2 Требования к химическим реактивам и приготовление растворов

4.2.1 Метанол для ВЭЖХ, массовая доля основного вещества w(CH3OH) не менее 99,8%.

4.2.2 Раствор серной кислоты молярной концентрации c(H2SO4) = 1 моль/дм3.

4.2.3 Раствор серной кислоты молярной концентрации c(H2SO4) = 1,5 моль/дм3.

4.2.4 Лимонная кислота моногидрат, массовая доля основного вещества w(C6H8O7·H2O) не менее 99,7%.

4.2.5 Гидрофосфат натрия 2-водный, массовая доля основного вещества w(Na2HPO4·2H2O) не менее 99,8%.

4.2.6 Глутатион, массовая доля основного вещества w(C10H17N3O6S) не менее 98%.

4.2.7 Этилендиаминтетраацетат натрия (ЭДТА) 2-водный, массовая доля основного вещества w(C10H14N2Na2O8·2H2O) не менее 99%.

4.2.8 Гидрофосфат калия, массовая доля основного вещества w(K2HPO4) не менее 96%.

4.2.9 Дигидрофосфат калия, массовая доля основного вещества w(KH2PO4) не менее 99,5%.

4.2.10 Приготовление цитратного буферного раствора

0,462 г моногидрата лимонной кислоты (4.2.4) и 1,05 г гидрофосфата натрия 2-водного (4.2.5) растворяют в 450 см3 дистиллированной воды. Устанавливают значение pH раствора, равное 5,7, при помощи раствора серной кислоты (4.2.3) и затем разбавляют раствор до объема 500 см3.

Срок хранения раствора - 1 день.

4.2.11 Приготовление раствора глутатиона массовой концентрации 

30 мг глутатиона (4.2.6) растворяют в 3 см3 дистиллированной воды.

Срок хранения раствора - 1 день.

4.2.12 Приготовление раствора ЭДТА массовой концентрации 

0,1 г ЭДТА (4.2.7) растворяют в 10 см3 дистиллированной воды.

Срок хранения раствора - 1 день.

4.2.13 Приготовление раствора гидрофосфата калия молярной концентрации c(K2HPO4) = 0,1 моль/дм3

17,4 г гидрофосфата калия (4.2.8) растворяют в 1000 см3 воды.

Срок хранения раствора - 2 дня.

4.2.14 Приготовление раствора дигидрофосфата калия молярной концентрации c(KH2PO4) = 0,1 моль/дм3

13,6 г дигидрофосфата калия (4.2.9) растворяют в 1000 см3 воды.

Срок хранения раствора - 2 дня.

4.2.15 Приготовление фосфатного буферного раствора с pH 6,0

Растворы гидрофосфата калия (4.2.13) и дигидрофосфата калия (4.2.14) смешивают в такой пропорции, чтобы значение pH приготовленного раствора составляло 6,0 (например, 30 объемных частей раствора по 4.2.13 и 70 объемных частей раствора по 4.2.14).

Срок хранения раствора - 7 дней при комнатной температуре.

4.2.16 Приготовление фосфатного буферного раствора с pH 7,0

Растворы гидрофосфата калия (4.2.13) и дигидрофосфата калия (4.2.14) смешивают в такой пропорции, чтобы значение pH приготовленного раствора составляло 7,0 (например, 40 объемных частей раствора по 4.2.13 и 60 объемных частей раствора по 4.2.14).

Срок хранения раствора - 7 дней при комнатной температуре.

4.2.17 Папаин порошкообразный (CAS 9001-73-4) с удельной каталитической активностью 15 нкат/мг <1> по отношению к этиловому эфиру N-бензоил-L-аргинина (BAEE) при pH 6,2 и 25 °C. Удельная каталитическая активность 15 нкат/мг соответствует 1 МЕ/мг (МЕ - международная единица каталитической активности).

--------------------------------

<1> Катал (кат) является производной единицей системы СИ для каталитической активности. 1 катал - это такая каталитическая активность, при которой скорость реакции при заданных условиях увеличивается на 1 моль/с.

4.2.18 Раствор папаина массовой концентрации 20 г/дм3

4.2.18.1 Приготовление раствора

1 г порошкообразного папаина (4.2.17) растворяют в 50 см3 цитратного буферного раствора (4.2.10). Срок хранения раствора - 5 дней при 4 °C.

4.2.18.2 Проверка активности папаина

Активность папаина может быть проверена путем приготовления второго экстракта (см. 6.2) с удвоенным количеством фермента. Найденное содержание биотина должно соответствовать расчетному значению и ни в коем случае не превышать его.

Примечание - При межлабораторных сравнительных испытаниях был использован порошкообразный папаин, поставщиком которого была компания VWR International GmbH, 20а, 64295 Darmstadt, Ref.-Nr 26.146.180t <1>.

--------------------------------

<1> Эта информация приведена исключительно для удобства пользователя настоящего стандарта и не является поддержкой указанного поставщика. Могут быть использованы аналогичные продукты, если доказано, что их применение приводит к идентичным результатам.

4.2.19 Конъюгат Авидин - флуоресцеинизотиоцианат (Avidin-FITC), содержащий 80% протеина (от 2 до 4 моль флуоресцеинизотиоцианата на каждый моль авидина).

4.2.20 Исходный раствор для послеколоночной дериватизации массовой концентрации 

2,5 мг конъюгата авидин - флуоресцеинизотиоцианат (4.2.19) растворяют в 50 см3 фосфатного буферного раствора с pH 7,0 (4.2.16). Срок хранения раствора - 14 дней при 4 °C.

4.2.21 Рабочий раствор для послеколоночной дериватизации массовой концентрации 

25 см3 исходного раствора для послеколоночной дериватизации (4.2.20) смешивают с 600 см3 фосфатного буферного раствора с pH 7,0 (4.2.16). Полученный раствор фильтруют через фильтр с размером пор 0,45 мкм (5.5). Раствор устойчив при хранении в темноте в течение 8 ч.

4.2.22 Подвижная фаза для ВЭЖХ

80 объемных частей фосфатного буферного раствора с pH 6,0 (4.2.15) смешивают с 20 объемными частями метанола (4.2.1) и фильтруют через фильтр с размером пор 0,45 мкм (5.5).

4.2.23 Така-диастаза, выделенная из Aspergillus Oryzae, удельная каталитическая активность 1500 нкат/мг (соответствует 100 МЕ/мг), для проб с высоким содержанием крахмала.