6.1 Подготовка испытуемой пробы
Испытуемую пробу гомогенизируют. Грубые материалы размалывают в подходящей мельнице и тщательно перемешивают. Чтобы исключить длительное воздействие высоких температур, пробу предварительно охлаждают.
Пробу массой от 0,5 до 10 г (что приблизительно соответствует содержанию D-биотина от 2 до 15 мкг) взвешивают с точностью до 1 мг и помещают в колбу Эрленмейера. К пробе добавляют 300 мм3 раствора глутатиона (4.2.11), 300 мм3 раствора ЭДТА (4.2.12), 30 см3 цитратного буферного раствора (4.2.10) и 3 см3 раствора папаина (4.2.18). При высоком содержании крахмала добавляют 100 мг така-диатазы (4.2.23). Смесь выдерживают в течение ночи в термостате при 37 °C при постоянном перемешивании. После охлаждения раствор переносят в мерную колбу вместимостью 50 см3 и разбавляют дистиллированной водой до метки. Раствор перемешивают и фильтруют через бумажный фильтр. Перед вводом в хроматограф его фильтруют еще раз через фильтр с размером пор 0,45 мкм (5.5).
Примечание - Фильтрование как подвижной фазы, так и растворов проб через мембранный фильтр перед применением или вводом в хроматограф продлевает срок службы колонок.
6.3 Проведение хроматографического анализа
Дозируют в ВЭЖХ-систему равные объемы градуировочных растворов и растворов проб. D-биотин идентифицируют путем сравнения времен удерживания пика на хроматограмме раствора пробы и градуировочных растворов. Идентификацию пиков можно также осуществить при помощи добавки образца сравнения к раствору пробы.
Из-за ограниченной стабильности раствора для послеколоночной дериватизации (4.2.21) ее регулярно проверяют при проведении серии измерений путем ввода градуировочного раствора. Приведенные ниже условия обеспечивают разделение и количественное определение D-биотина:
Хроматографическая колонка: 
100 RP-18 endcapped, 5 мкм, 250 x 4,0 мм;
Подвижная фаза: 80 объемных частей фосфатного буферного раствора с pH 6 (4.2.15) и 20 объемных частей метанола (4.2.1);
Расход подвижной фазы: 0,4 см3/мин;
Объем инжектирования: 30 мм3;
Флуоресцентное детектирование: длина волны возбуждения 490 нм, длина волны регистрации 520 нм;
Расход реагента для послеколоночной дериватизации: 1 см3/мин.
Примечание - Этот метод может быть также использован для оценки содержания D-биоцитина.