"МУК 4.1.2082-06. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Методические указания по определению остаточных количеств Трибенурон-метила в семенах и масле подсолнечника методом высокоэффективной жидкостной хроматографии" (утв. Роспотребнадзором 30.07.2006)

Утверждаю

Руководитель Федеральной

службы по надзору в сфере

защиты прав потребителей

и благополучия человека,

Главный государственный

санитарный врач

Российской Федерации

Г.Г.ОНИЩЕНКО

30 июля 2006 года

4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ ТРИБЕНУРОН-МЕТИЛА

В СЕМЕНАХ И МАСЛЕ ПОДСОЛНЕЧНИКА МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ

ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

МУК 4.1.2082-06

Дата введения

1 сентября 2006 года

1. Методические указания подготовлены Федеральным научным центром гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана при участии специалистов Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

3. Утверждены Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации, академиком РАМН Г.Г. Онищенко.

4. Введены впервые.

Настоящие Методические указания устанавливают метод высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения в семенах и масле подсолнечника Трибенурон-метила.

Производитель: Дюпон де Немур.

Торговое наименование препарата: Гранстар.

Название действующего вещества по номенклатуре ИСО: Трибенурон-метил.

Название действующего вещества по ИЮПАК: метил 2-[4-метокси-6-метил-1,3,5-триазин-2-ил(метил)карбамоилсульфамоил]бензоат.

Структурная формула (не приводится).

Эмпирическая формула: C H N O S.

15 17 5 6

Молекулярная масса: 395,4.

Химически чистый Трибенурон-метил представляет собой белый порошок с

легким горьковатым запахом.

Температура плавления: 142 °С.

-5

Давление паров 5,2 х 10 мПа (при 25 °С).

Растворимость в воде 0,05 г/л (pH 5), 2,04 г/л (pH 7), 18,3 г/л (pH 9)

(при 20 °С).

Растворимость в органических растворителях (г/л при 20 °С): ацетон -

-4 4 4

3,91 х 10 , ацетонитрил - 4,64 х 10 , этилацетат - 1,63 х 10 , метанол -

3

2,59 х 10 ; н-гептан - 20,8 мг/л (при 20 °С).

Трибенурон-метил - слабая кислота с рКа 4,7.

Стабилен при pH 9, гидролизуется при pH 5 с DT менее 1 дня, при pH 7

50

- DT - 15,8 дней при температуре 25 °С. Не наблюдается значительного

50

фотолитического разложения в диапазоне pH 5 - 9 при температуре 25°.

Трибенурон-метил - гербицид листового системного действия, подавляющий

развитие двудольных сорняков в посевах злаковых культур, по механизму

действия относится к ингибиторам ацетолактатсинтетазы, что приводит к

прекращению деления клеток. Проникает в растения через листья, при

попадании на почву активности не проявляет.

Краткая токсикологическая характеристика: Трибенурон-метил относится к

малоопасным веществам по острой пероральной токсичности (LD для крыс

50

> 5000 мг/кг) и острой дермальной токсичности (LD для кроликов > 5000

50

мг/кг), но к умеренно опасным по острой ингаляционной токсичности (LC для

50

крыс) (4 часа) > 5000 мг/куб. м воздуха. Не вызывает покраснения глаз у

кроликов; слабо сенсибилизирует кожу гвинейских свиней. Не обладает

генотоксичностью.

В России для Трибенурон-метила установлены следующие гигиенические нормативы:

ДСД - 0,01 мг/кг/сутки;

МДУ в зерне хлебных злаков - не допускается.

Рекомендуемый МДУ в семенах и масле подсолнечника - 0,02 мг/кг.

Зарегистрирован в России под торговым названием Гранстар, СТС. Рекомендован для борьбы с однолетними двудольными, бодяком полевым и однолетними злаковыми сорняками в посевах зерновых, включая пшеницу, ячмень и овес с нормой расхода 10 - 25 г/га. Препарат испытывается в посевах трансгенных сортов подсолнечника, устойчивых к Трибенурон-метилу.

1. МЕТРОЛОГИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности Р = 0,95 не превышает значений, приведенных в таблице 1 для соответствующих диапазонов концентраций.

Таблица 1

МЕТРОЛОГИЧЕСКИЕ ПАРАМЕТРЫ

┌───────────┬─────────────┬─────────────┬─────────────┬─────────┬─────────┐

│Анализируе-│ Диапазон │ Показатель │ Стандартное │Предел │Предел │

│мый объект │определяемых │ точности │ отклонение │повторяе-│воспроиз-│

│ │концентраций,│ (граница │повторяемости│мости r, │водимости│

│ │ мг/кг │относительной│ сигма , % │% │R, % │

│ │ │погрешности) │ r │ │ │

│ │ │ +/- дельта, │ │ │ │

│ │ │ %, Р = 0,95 │ │ │ │

├───────────┼─────────────┼─────────────┼─────────────┼─────────┼─────────┤

│Семена под-│0,005 - 0,01 │100 │1,6 │5 │6 │

│солнечника ├─────────────┼─────────────┼─────────────┼─────────┼─────────┤

│ │0,01 - 0,1 │50 │2,8 │8 │10 │

├───────────┼─────────────┼─────────────┼─────────────┼─────────┼─────────┤

│Масло под- │0,005 - 0,01 │100 │2,0 │6 │7 │

│солнечника ├─────────────┼─────────────┼─────────────┼─────────┼─────────┤

│ │0,01 - 0,1 │50 │2,5 │7 │9 │

└───────────┴─────────────┴─────────────┴─────────────┴─────────┴─────────┘

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительные интервалы среднего результата для полного диапазона концентраций (n = 20) приведены в таблице 2.

Таблица 2

ПОЛНОТА ИЗВЛЕЧЕНИЯ ВЕЩЕСТВА, СТАНДАРТНОЕ ОТКЛОНЕНИЕ,

ДОВЕРИТЕЛЬНЫЙ ИНТЕРВАЛ СРЕДНЕГО РЕЗУЛЬТАТА

Анализируе-

мый объект

Метрологические параметры, Р = 0,95, n = 20

Предел

обнару-

жения,

мг/кг

Диапазон

определяемых

концентраций,

мг/кг

Среднее

значение

определения,

%

Стандартное

отклонение

S, %

Доверительный

интервал

среднего

результата

+/-, %

Семена под-

солнечника

0,01

0,01 - 0,1

74,9

2,8

0,95

Масло под-

солнечника

0,01

0,01 - 0,1

80,2

2,6

0,97

2. МЕТОД ИЗМЕРЕНИЙ

Метод основан на определении Трибенурон-метила методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с использованием ультрафиолетового детектора после его экстракции из образцов органическим растворителем, очистки перераспределением между двумя несмешивающимися фазами и на концентрирующих патронах на основе силикагеля (Диапак С и Диапак С16). При недостаточной чистоте экстракта его очищают дополнительно на патроне Диапак Диол.

Идентификация вещества проводится по времени удерживания, а количественное определение - методом абсолютной калибровки.

В предлагаемых условиях метод специфичен в присутствии пестицидов, применяемых при выращивании подсолнечника.

3. СРЕДСТВА ИЗМЕРЕНИЙ, РЕАКТИВЫ,

ВСПОМОГАТЕЛЬНЫЕ УСТРОЙСТВА И МАТЕРИАЛЫ

3.1. Средства измерений

Весы аналитические ВЛА-200 - ГОСТ 34104-80Е.

Весы лабораторные общего назначения с наибольшим пределом взвешивания до 500 г и пределом допустимой погрешности +/- 0,038 г - ГОСТ 19491-74.

Колбы мерные на 25, 50 и 100 куб. см - ГОСТ 1770-74.

Микрошприц для жидкостного хроматографа на 50 - 100 куб. мм.

Пипетки мерные на 1,0; 2,0 и 5,0 куб. см - ГОСТ 20292-74.

Потенциометр - pH-метр - 150М - ГОСТ 2261.

Хроматограф жидкостной Уотерс 510 с ультрафиолетовым детектором с изменяемой длиной волны и чувствительностью не ниже 0,005 единиц адсорбции на шкалу; N государственной регистрации 15311-02.

Цилиндры мерные 2-го класса точности вместимостью 25, 50 и 100 куб. см - ГОСТ 1770.

Допускается использование средств измерений с аналогичными или лучшими характеристиками.

3.2. Реактивы

Трибенурон-метил, аналитический стандарт с содержанием действующего вещества 97,7% (фирма Дюпон, США).

Ацетон, о.с.ч. - ТУ 2633-00-4-11291058-94.

Ацетонитрил, о.с.ч., УФ-205 нм - ТУ 6-09-2167-84.

Вода бидистиллированная, деионизированная - ГОСТ 7602-72.

Гексан, х.ч., для спектроскопии - ТУ 6-09-06-657-84.

Калий фосфорнокислый двузамещенный (K HPO ) - ГОСТ 2498-75.

2 4

Калий марганцовокислый, ч.д.а. - ГОСТ 20490-75.

Кальций хлористый, х.ч. - ГОСТ 4161-76.

Кислота ортофосфорная, х.ч. - ГОСТ 6552-80.

Кислота серная концентрированная, ч. - ГОСТ 4204-77.

Кислота уксусная ледяная - ГОСТ 61-75.

Метилен хлористый, х.ч. - ТУ 6-09-2662-77.

Натрия гидрокарбонат, х.ч. - ГОСТ 2156-76.

Натрий сернокислый безводный, х.ч. - ГОСТ 4166-76.

Натрий хлористый, х.ч. - ГОСТ 4233-77.

Концентрирующие патроны Диапак С (0,6 г) - ТУ 4215-002-05451931-94.

Концентрирующие патроны Диапак С16 (0,6 г) - ТУ 4215-002-05451931-94.

Концентрирующие патроны Диапак Диол (0,6 г) - ТУ 4215-002-05451931-94.

3.3. Вспомогательные устройства и материалы

Алонж прямой с отводом для вакуума для работы с концентрирующими патронами Диапак С, Диапак Диол и Диапак С16 фирмы БиоХимМак.

Ванна ультразвуковая UM 4, фирма Unitra.

Воронки делительные на 250 и 500 мл - ГОСТ 25336-82Е.

Воронки конические стеклянные диаметром 50 - 60 мм - ГОСТ 25336-82Е.

Колонка хроматографическая стальная длиной 250 мм, внутренним диаметром 4,6 мм, Symmetry Shield RP18, зернение 5 мкм, фирма Уотерс.

Колбы конические плоскодонные на 500 и 1000 куб. см - ГОСТ 9737-70.

Концентраторы грушевидные и круглодонные объемом 50, 100 и 250 куб. см - ГОСТ 10394-75.

Насос диафрагменный FT.19 фирмы KNF Neu Laboport.

Предколонка хроматографическая стальная Symmetry С18 длиной 20 мм, внутренним диаметром 3,9 мм, зернение 5 мкм, фирма Уотерс.

Испаритель ротационный Rotavapor R110 Buchi с водяной баней В-480.

Стаканы стеклянные на 100 - 500 куб. см - ГОСТ 25366-80Е.

Установка для перегонки растворителей.

Фильтры бумажные "красная лента", ТУ-6-09-1678-86.

Фильтры для очистки растворителей диаметром 20 мм с отверстиями пор 20 мкм, фирма Уотерс, или аналогичные.

Флаконы полипропиленовые объемом 20 куб. см; 250 куб. см.

4. ТРЕБОВАНИЯ БЕЗОПАСНОСТИ

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостный хроматограф.

4.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать норм, установленных ГН 2.2.5.1313-03 "Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны". Организация обучения работников безопасности труда по ГОСТ 12.0.004.

5. ТРЕБОВАНИЯ К КВАЛИФИКАЦИИ ОПЕРАТОРОВ

К выполнению измерений допускают специалистов, имеющих квалификацию не ниже лаборанта-исследователя, с опытом работы на жидкостном хроматографе.

К проведению пробоподготовки допускают оператора с квалификацией "лаборант", имеющего опыт работы в химической лаборатории.

6. УСЛОВИЯ ИЗМЕРЕНИЙ

При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °С и относительной влажности не более 80%;

- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

7. ПОДГОТОВКА К ОПРЕДЕЛЕНИЮ

7.1. Подготовка органических растворителей

7.1.1. Очистка ацетона.

Ацетон перегоняют над небольшим количеством перманганата калия (А. Гордон, Р. Форд, Спутник химика, Москва, 1976 г., с. 438 - 439).

7.1.2. Очистка ацетонитрила.

Ацетонитрил перегоняют.

7.1.3. Очистка гексана.

Гексан встряхивают с концентрированной серной кислотой, промывают бледно-розовым раствором перманганата калия до тех пор, пока раствор не перестанет обесцвечиваться, затем промывают водой, сушат над безводным хлористым кальцием и перегоняют (А. Гордон, Р. Форд, Спутник химика, Москва, 1976 г., с. 441).

7.1.4. Очистка хлористого метилена.

Хлористый метилен встряхивают с концентрированной серной кислотой, промывают водным раствором карбоната натрия, водой, сушат над безводным хлористым кальцием и перегоняют над оксидом (V) фосфора (А. Гордон, Р. Форд, Спутник химика, Москва, 1976 г., с. 440)

7.1.5. Очистка бидистиллированной воды.

Бидистиллят кипятят в течение 6 часов с марганцовокислым калием, добавленным из расчета 1 г/л, и затем перегоняют.

7.2. Приготовление растворов для проведения анализа

7.2.1. Приготовление буфера 0,05 М калия фосфорнокислого двузамещенного, pH 9.

В мерную колбу объемом 1000 куб. см помещают 800 куб. см дистиллированной воды и растворяют в ней 8,75 г М калия фосфорнокислого двузамещенного и 100 г натрия хлористого, доводят pH (по pH-метру) до 9, используя 1 М раствор едкого натра, после чего доводят раствор до метки дистиллированной водой.

7.2.2. Приготовление 10%-ного раствора ортофосфорной кислоты.

В мерную колбу объемом 100 куб. см помещают 50 куб. см дистиллированной воды и 10 г концентрированной (85%) ортофосфорной кислоты, перемешивают и доводят до метки дистиллированной водой.

7.2.3. Приготовление 0,1%-ной ледяной уксусной кислоты в ацетоне.

В мерную колбу объемом 100 куб. см помещают 50 куб. см ацетона (свежеперегнанного над перманганатом калия) и 0,1 куб. см ледяной уксусной кислоты, перемешивают, доводят до метки ацетоном, еще раз перемешивают и используют для анализа.

7.3. Приготовление растворов для жидкостной хроматографии

Для приготовления подвижной фазы используют свежеперегнанные ацетонитрил и очищенную воду.

7.3.1. Приготовление 0,05%-ного раствора уксусной кислоты.

В мерную колбу объемом 1,0 куб. дм помещают 500 куб. см очищенной воды и 0,5 куб. см ледяной уксусной кислоты, перемешивают, доводят до метки очищенной водой и еще раз перемешивают.

7.3.2. Приготовление подвижной фазы для ВЭЖХ.

В плоскодонную колбу объемом 1 куб. дм помещают 500 куб. см ацетонитрила и 500 куб. см раствора 0,05%-ной уксусной кислоты в очищенной воде. Смесь тщательно перемешивают, пропускают через нее газообразный гелий со скоростью 20 куб. см/мин. в течение 5 минут, после чего помещают в ультразвуковую ванну для удаления растворенных газов на 1 минуту.

7.4. Приготовление градуировочных растворов

7.4.1. Стандартный раствор с концентрацией Трибенурон-метила 1,0 мг/куб. см.

Взвешивают 100 мг Трибенурон-метила в мерной колбе объемом 100 куб. см. Навеску растворяют в ацетонитриле и доводят объем до метки ацетонитрилом. Стандартный раствор можно хранить в морозильной камере в течение шести месяцев.

7.4.2. Стандартный раствор с концентрацией Трибенурон-метила 10,0 мкг/куб. см.

Из стандартного раствора Трибенурон-метила с концентрацией 1,0 мг/куб. см отбирают мерной пипеткой 1 куб. см, помещают в мерную колбу объемом 100 куб. см и доводят объем до метки ацетонитрилом при перемешивании. Стандартный раствор можно хранить в холодильнике в течение одного месяца.

7.4.3. Стандартные растворы Трибенурон-метила с концентрацией 1,0; 0,5; 0,2 и 0,1 мкг/куб. см для построения калибровочной кривой.

Методом последовательного разведения ацетонитрилом готовят растворы, содержащие по 1,0; 0,5; 0,2 и 0,1 мкг/куб. см, и используют эти растворы для хроматографического исследования. Растворы готовят в стеклянных мерных колбах и затем переносят в полипропиленовые герметичные флаконы объемом 20 куб. см. Растворы в полипропиленовых герметичных флаконах можно хранить в холодильнике в течение 5 дней. В стеклянной таре Трибенурон-метил разрушается в течение рабочего дня.

7.4.4. Стандартные растворы Трибенурон-метила с концентрацией 2,0; 1,0; 0,5 и 0,2 мкг/куб. см для внесения в образцы семян и масла подсолнечника.

Для внесения в исследуемые образцы семян и масла подсолнечника готовят растворы Трибенурон-метила в ацетоне. Из раствора Трибенурон-метила в ацетонитриле с концентрацией 10 мкг/куб. см методом последовательного разведения ацетоном готовят растворы, содержащие 2,0; 1,0; 0,4; 0,2 мкг/куб. см Трибенурон-метила. Растворы готовят в стеклянных мерных колбах и затем переносят в полипропиленовые герметичные флаконы объемом 20 куб. см. Растворы для внесения в образцы готовят непосредственно перед проведением анализа и не хранят.

7.5. Установление градуировочной характеристики

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади (высоты) пика от концентрации Трибенурон-метила в растворе, устанавливают методом абсолютной калибровки по стандартным растворам с концентрациями 1,0; 0,5; 0,2 и 0,1 мкг/куб. см.

Для построения градуировочного графика в инжектор хроматографа вводят по 20 куб. мм каждого градуировочного раствора и хроматографируют в условиях п. 9.2. Проводят не менее 3 параллельных измерений и находят среднее значение площади хроматографического пика для каждой концентрации. По полученным данным строят градуировочный график зависимости площади хроматографического пика в мВ от концентрации Трибенурон-метила в растворе в мкг/куб. см.

7.6. Подготовка концентрирующих патронов Диапак С, Диапак С16 и Диапак Диол для очистки экстрактов

7.6.1. Подготовка концентрирующего патрона Диапак С для очистки экстракта.

Все процедуры происходят с использованием вакуума, скорость потока растворов через патрон не должна превышать 5 куб. см/мин.

Патрон Диапак С устанавливают на аллонж с отводом для вакуума, сверху в патрон вставляют шприц с разъемом типа Люер объемом не менее 10 куб. см (используют как емкость для элюентов).

Кондиционирование: концентрирующий патрон промывают последовательно 5 куб. см ацетона и 5 куб. см смеси гексан - ацетон в соотношении 9:1. Элюат отбрасывают.

Нельзя допускать высыхания поверхности патрона!

7.6.1.1. Проверка хроматографического поведения Трибенурон-метила на концентрирующем патроне Диапак С.

Из стандартного раствора Трибенурон-метила в ацетонитриле, содержащего 1 мкг/куб. см, отбирают 1 мл, помещают в круглодонную колбу объемом 100 куб. см и выпаривают на ротационном вакуумном испарителе досуха при температуре не выше 30 °С.

Сухой остаток растворяют в 1 куб. см ацетона, помещают на 10 секунд в ультразвуковую ванну и тщательно обмывают стенки концентратора. Затем в концентратор 1 добавляют 9 куб. см гексана, смесь тщательно перемешивают, и полученный раствор вносят на патрон. Элюат собирают в чистый концентратор, выпаривают досуха, сухой остаток растворяют в 2 куб. см ацетонитрила и хроматографируют.

Концентратор вновь тщательно обмывают 10 куб. см смеси гексан - ацетон в соотношении 9:1 и двумя порциями по 5 куб. см смеси гексан - ацетон в соотношении 9:1, и смывы последовательно также вносят на патрон, собирая каждую фракцию в чистые концентраторы и хроматографируя их. Затем концентратор обмывают еще двумя порциями по 10 куб. см 0,1%-ной ледяной уксусной кислоты в ацетоне. Элюат после прохождения каждой порции собирают в чистые концентраторы, выпаривают досуха, сухой остаток растворяют в 2 куб. см ацетонитрила и хроматографируют. Определяют фракции, содержащие Трибенурон-метил, и объединяют их.

7.6.2. Подготовки концентрирующего патрона Диапак С16 для очистки экстракта.

Все процедуры происходят с использованием вакуума, скорость потока растворов через патрон не должна превышать 5 куб. см/мин. При работе на патронах Диапак С16 используют очищенную воду.

Патрон Диапак С16 устанавливают на алонж с отводом для вакуума, сверху в патрон вставляют шприц с разъемом типа Люер объемом не менее 10 куб. см (используют как емкость для элюентов).

Кондиционирование: концентрирующий патрон промывают 5 куб. см смеси ацетонитрил - вода в соотношении 1:1. Элюат отбрасывают.

Нельзя допускать высыхания поверхности патрона!

7.6.2.1. Проверка хроматографического поведения Трибенурон-метила на концентрирующем патроне Диапак С16.

Из стандартного раствора Трибенурон-метила в ацетонитриле, содержащего 1 мкг/куб. см, отбирают 1 куб. см, помещают в концентратор объемом 100 куб. см и выпаривают на ротационном вакуумном испарителе досуха при температуре не выше 30 °С.

Сухой остаток растворяют в 5 куб. см ацетонитрила и тщательно обмывают стенки концентратора. Затем в концентратор добавляют 5 куб. см воды. Смесь тщательно перемешивают и полученный раствор вносят на патрон. Элюат собирают в чистый концентратор, выпаривают досуха, сухой остаток растворяют в 2 мл ацетонитрила и хроматографируют.

Концентратор вновь обмывают двумя порциями по 5 куб. см смеси ацетонитрил - вода в соотношении 1:1 и каждую порцию раздельно вносят на патрон. Элюат после прохождения каждой порции собирают в чистые концентраторы, выпаривают досуха, сухой остаток растворяют в 2 куб. см ацетонитрила и хроматографируют. Определяют фракции, содержащие Трибенурон-метил, и объединяют их.

7.6.3. Подготовка концентрирующего патрона Диапак Диол для очистки экстракта.

Все процедуры происходят с использованием вакуума, скорость потока растворов через патрон не должна превышать 5 куб. см/мин.

Патрон Диапак С устанавливают на аллонж с отводом для вакуума, сверху в патрон вставляют шприц с разъемом типа Люер объемом не менее 10 куб. см (используют как емкость для элюентов).

Кондиционирование: концентрирующий патрон промывают последовательно 5 куб. см ацетона и 5 куб. см смеси гексан - ацетон в соотношении 9:1. Элюат отбрасывают.

Нельзя допускать высыхания поверхности патрона!

7.6.3.1. Проверка хроматографического поведения Трибенурон-метила на концентрирующем патроне Диапак Диол.

Из стандартного раствора Трибенурон-метила в ацетонитриле, содержащего 1 мкг/куб. см, отбирают 1 куб. см, помещают в концентратор 1 объемом 100 куб. см и выпаривают на ротационном вакуумном испарителе досуха при температуре не выше 30 °С.

Сухой остаток растворяют в 1 куб. см ацетона, помещают на 10 секунд в ультразвуковую ванну и тщательно обмывают стенки концентратора. Затем в концентратор добавляют 9 куб. см гексана, смесь тщательно перемешивают, и полученный раствор вносят на патрон. Элюат собирают в чистый концентратор, выпаривают досуха, сухой остаток растворяют в 2 куб. см ацетонитрила и хроматографируют.

Концентратор тщательно обмывают 10 куб. см смеси гексан - ацетон в соотношении 9:1 и двумя порциями по 5 куб. см смеси гексан - ацетон в соотношении 9:1 и последовательно вносят на патрон. Затем концентратор обмывают двумя порциями по 10 куб. см гексан - ацетон в соотношении 4:1, порции также последовательно наносят на патрон. Элюаты после прохождения каждой порции собирают в чистые концентраторы, выпаривают досуха, сухой остаток растворяют в 2 куб. см ацетонитрила и хроматографируют. Определяют фракции, содержащие Трибенурон-метил, и объединяют их.

7.7. Подготовка и кондиционирование колонки для жидкостной хроматографии

Хроматографическую колонку Symmetry Shield RP18 с предколонкой Symmetry C18 устанавливают в термостате хроматографа и стабилизируют при температуре 25 °С и скорости потока подвижной фазы 1 куб. см/мин. 3 - 4 часа.

8. ОТБОР ПРОБ И ХРАНЕНИЕ ПРОБ

Отбор проб производится в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" (N 2051-79 от 21.08.79). Семена подсолнечника, подсушенные до стандартной влажности, хранят в тканевых мешочках в сухом защищенном от света месте при комнатной температуре не более 6-ти месяцев. Влажные семена замораживают и хранят в морозильной камере при -14 °С до 1 года. Пробы масла подсолнечника хранят в плотно закрытой стеклянной или полиэтиленовой таре в холодильнике при температуре 0 - 4 °С в течение 10 суток.

9. ПРОВЕДЕНИЕ ОПРЕДЕЛЕНИЙ

9.1. Семена подсолнечника

9.1.1. Экстракция.

Образец измельченных семян подсолнечника массой 20 г помещают в полипропиленовый флакон объемом 250 куб. см, прибавляют 75 куб. см гексана и помещают в ультразвуковую ванну, нагретую до температуры 30 °С, на 10 минут. Затем флакон встряхивают 10 минут на механическом встряхивателе при комнатной температуре, центрифугируют 5 минут при скорости 4000 оборотов в минуту. Надосадочную жидкость фильтруют в концентратор объемом 250 куб. см, и экстракт упаривают до маслянистого остатка на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С.

9.1.2. Очистка экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей.

К маслянистому остатку в концентраторе, полученному по п. 9.1.1, прибавляют 20 куб. см гексана, обмывают стенки концентратора и переносят раствор в делительную воронку объемом 250 куб. см. Концентратор обмывают еще двумя порциями гексана объемом 20 и 10 куб. см и объединяют все смывы в делительной воронке.

Трибенурон-метил экстрагируют из гексанового раствора тремя порциями ацетонитрила объемом по 20 куб. см. После полного разделения слоев в делительной воронке нижний ацетонитрильный слой собирают в концентратор объемом 250 куб. см через слой безводного сульфата натрия толщиной 1 см. Гексан отбрасывают. Ацетонитрильный экстракт упаривают до маслянистого остатка на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С.

К маслянистому остатку в концентраторе прибавляют 20 куб. см гексана, обмывают стенки концентратора и переносят смыв в делительную воронку объемом 250 куб. см. Концентратор обмывают еще двумя порциями гексана объемом 20 и 10 куб. см и объединяют все смывы в делительной воронке.

В ту же делительную воронку прибавляют 20 куб. см фосфатного буфера (pH 9) и интенсивно встряхивают 2 минуты. Оставляют делительную воронку на 5 минут при комнатной температуре для лучшего разделения слоев. Затем нижний водный слой с эмульсией помещают в химический стакан объемом 200 куб. см. Из оставшегося гексанового слоя Трибенурон-метил экстрагируют еще двумя порциями фосфатного буфера (pH 9), встряхивая каждый раз делительную воронку 2 минуты, оставляя после встряхивания воронку на 5 минут при комнатной температуре и сливая водную фракцию в химический стакан. Гексан отбрасывают, нижние водные слои с эмульсией объединяют и переносят в чистую делительную воронку.

К водной фракции в делительную воронку прибавляют 100 куб. см гексана, встряхивают содержимое 2 минуты и оставляют на 10 минут при комнатной температуре. Затем нижний водный слой с небольшим количеством эмульсии собирают в химический стакан объемом 200 куб. см, гексан отбрасывают. Водную фазу с эмульсией возвращают в делительную воронку. Туда же прибавляют 30 куб. см фосфатного буфера, 50 куб. см гексана, интенсивно встряхивают делительную воронку 2 минуты и оставляют при комнатной температуре до полного разделения слоев (приблизительно 10 минут). Нижний водный слой собирают в химический стакан объемом 200 куб. см, верхний гексановый слой отбрасывают.

Водный экстракт возвращают в воронку и подкисляют 10%-ной ортофосфорной кислотой до pH 4 (по pH-метру). Подкисление следует проводить как можно быстрее, чтобы минимизировать возможность гидролиза Трибенурон-метила в кислом водном растворе. Трибенурон-метил экстрагируют тремя порциями свежеперегнанного хлористого метилена объемом по 30 куб. см, интенсивно встряхивая каждый раз делительную воронку по 2 минуты. После полного разделения слоев нижний слой хлористого метилена объединяют в концентраторе объемом 250 куб. см, пропуская через слой безводного сульфата натрия, и выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С.

9.1.3. Очистка экстракта на концентрирующих патронах Диапак С и Диапак С16.

9.1.3.1. Очистка экстракта на концентрирующем патроне Диапак С.

Сухой остаток растворяют в 1 куб. см ацетона, помещают на 10 секунд в ультразвуковую ванну и тщательно обмывают стенки концентратора. Затем в концентратор добавляют 9 куб. см гексана, смесь тщательно перемешивают и полученный раствор вносят на патрон. Концентратор тщательно обмывают двумя порциями смеси гексан - ацетон в соотношении 9:1 по 10 и 5 куб. см и также вносят на патрон. Элюаты отбрасывают.

Трибенурон-метил элюируют с патрона 10 куб. см 0,1%-ной уксусной кислоты в ацетоне, выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С.

9.1.3.2. Очистка экстракта на концентрирующем патроне Диапак С16.

Сухой остаток растворяют в 5 куб. см ацетонитрила, тщательно обмывая стенки концентратора. Затем в концентратор добавляют 5 куб. см воды, тщательно перемешивают и полученный раствор вносят на патрон. Концентратор обмывают 5 куб. см смеси ацетонитрил - вода в соотношении 1:1 и вносят на патрон. Элюаты собирают в концентратор, выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С.

9.1.3.3. Очистка экстракта на концентрирующем патроне Диапак Диол.

Сухой остаток растворяют в 1 куб. см ацетона, помещают на 10 секунд в ультразвуковую ванну и тщательно обмывают стенки концентратора. Затем в концентратор добавляют 9 куб. см гексана, смесь тщательно перемешивают и полученный раствор вносят на патрон. Концентратор тщательно обмывают 10 куб. см смеси гексан - ацетон в соотношении 9:1 и также вносят на патрон. Концентратор тщательно обмывают 10 куб. см смеси гексан - ацетон в соотношении 4:1 и также вносят на патрон. Все элюаты объединяют и выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С. Сухой остаток растворяют в 2 куб. см ацетонитрила и аликвоту 20 куб. мм вводят в хроматограф.

После хроматографирования каждой пробы следует промывать колонку не менее 40 минут.

9.2. Масло подсолнечника

9.2.1. Экстракция.

Образец масла подсолнечника массой 20 г помещают в химический стакан объемом 100 мл, прибавляют 40 куб. см гексана, тщательно перемешивают и переносят в сухую делительную воронку объемом 250 куб. см. Затем химический стакан обмывают тремя порциями гексана объемом по 20 куб. см и объединяют с раствором в делительной воронке. Трибенурон-метил экстрагируют из гексанового раствора тремя порциями ацетонитрила объемом по 30 куб. см. После полного разделения слоев в делительной воронке нижний ацетонитрильный слой собирают в концентратор объемом 250 куб. см через слой безводного сульфата натрия толщиной 1 см. Гексан отбрасывают. Ацетонитрильный экстракт упаривают до маслянистого остатка на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С.

9.2.2. Очистка экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей.

К маслянистому остатку в концентраторе, полученному по п. 9.2.1, прибавляют 20 куб. см гексана, обмывают стенки концентратора и переносят смыв в делительную воронку объемом 250 мл. Концентратор обмывают еще двумя порциями гексана объемом 20 и 10 куб. см и объединяют все смывы в делительной воронке. В ту же делительную воронку прибавляют 20 куб. см фосфатного буфера (pH 9) и интенсивно встряхивают 2 минуты. Оставляют делительную воронку на 5 минут при комнатной температуре для лучшего разделения слоев. Затем нижний водный слой с эмульсией помещают в химический стакан объемом 200 куб. см.

Из оставшегося гексанового слоя Трибенурон-метил экстрагируют еще двумя порциями фосфатного буфера (pH 9), встряхивая каждый раз делительную воронку 2 минуты и оставляя после встряхивания воронку на 5 минут при комнатной температуре. Гексан отбрасывают, нижние водные слои с эмульсией объединяют и переносят в делительную воронку.

Прибавляют в делительную воронку 100 куб. см гексана, встряхивают содержимое 2 минуты и оставляют на 10 минут при комнатной температуре. Затем нижний водный слой с небольшим количеством эмульсии собирают в химический стакан объемом 200 куб. см, гексан отбрасывают. Водную фазу с эмульсией возвращают в делительную воронку. Туда же прибавляют 30 куб. см фосфатного буфера, 50 куб. см гексана, интенсивно встряхивают делительную воронку 2 минуты и оставляют при комнатной температуре до полного разделения слоев (приблизительно 10 минут). Нижний водный слой собирают в химический стакан объемом 200 куб. см, верхний гексановый слой отбрасывают.

Водный экстракт подкисляют 10%-ной ортофосфорной кислотой до pH 4 (по pH-метру) и возвращают в воронку. (Подкисление следует проводить как можно быстрее, чтобы минимизировать возможность гидролиза Трибенурон-метила в кислом водном растворе.) Трибенурон-метил экстрагируют тремя порциями свежеперегнанного хлористого метилена объемом по 30 куб. см, интенсивно встряхивая каждый раз делительную воронку по 2 минуты. После полного разделения слоев нижний слой хлористого метилена объединяют в концентраторе объемом 250 куб. см, пропуская через слой безводного сульфата натрия, и выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С.

9.2.3. Очистка экстракта на концентрирующих патронах Диапак С и Диапак С16.

Сухой остаток, полученный по п. 9.2.2, растворяют в 1 куб. см ацетона, добавляют 9 куб. см гексана и очищают на патронах Диапак С, Диапак С16 и Диапак Диол, как указано в п. 9.1.3.1, 9.1.3.2 и 9.1.3.3. После очистки элюат выпаривают досуха, растворяют в 2 куб. см ацетонитрила и хроматографируют.

После хроматографирования каждых двух проб следует промывать колонку не менее 40 минут.

9.3. Условия хроматографирования

Хроматограф "Waters" или другой с аналогичными характеристиками с ультрафиолетовым детектором с изменяемой длиной волны.

Колонка стальная Symmetry Shield RP18, 4,6 мм х 25 см, зернением 5 мкм.

Предколонка стальная Symmetry RP18, 3,9 мм х 2 см, зернением 5 мкм.

Температура колонки: 25 °С.

Подвижная фаза: ацетонитрил - 0,05%-ная уксусная кислота в соотношении 1:1.

Длина волны 240 нм.

Время удерживания Трибенурон-метила: 9,1 - 9,6 мин.

Чувствительность 0,005 ед. оптической плотности на шкалу.

Объем вводимой пробы 20 куб. мм.

Линейный диапазон детектирования сохраняется в пределах 2 - 20 нг.

10. ОБРАБОТКА РЕЗУЛЬТАТОВ

Содержание Трибенурон-метила рассчитывают по формуле:

Sпр х А х V

Х = ------------- х Р,

100 х Sст х m

где:

Х - содержание Трибенурон-метила в пробе, мг/кг;

Sст - высота (площадь) пика стандарта, мм;

Sпр - высота (площадь) пика образца, мм;

А - концентрация стандартного раствора, мкг/мл;

V - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, куб. см;

m - масса анализируемого образца, г;

Р - содержание Трибенурон-метила в аналитическом стандарте, %.

11. ПРОВЕРКА ПРИЕМЛЕМОСТИ РЕЗУЛЬТАТОВ

ПАРАЛЛЕЛЬНЫХ ОПРЕДЕЛЕНИЙ

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):

2 х |Х - Х | х 100

1 2

------------------- <= r, (1)

(Х + Х )

1 2

где:

Х , Х - результаты параллельных определений, мг/кг;

1 2

r - значение предела повторяемости (таблица 1), при этом

r = 2,8 сигма .

r

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

12. ОФОРМЛЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Результат анализа представляют в виде:

_

(Х +/- ДЕЛЬТА), мг/кг, при вероятности Р = 0,95,

где:

_

Х - среднее арифметическое результатов определений, признанных

приемлемыми, мг/кг;

ДЕЛЬТА - граница абсолютной погрешности, мг/кг;

_

ДЕЛЬТА = дельта х Х / 100,

дельта - граница относительной погрешности методики (показатель

точности в соответствии с диапазоном концентраций, таблица 1), %.

В случае если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

"содержание вещества в пробе менее 0,1 мг/кг" <*>.

--------------------------------

<*> 0,01 мг/кг - предел обнаружения.

13. КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА РЕЗУЛЬТАТОВ ИЗМЕРЕНИЙ

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

13.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится методом добавок.

Величина добавки С должна удовлетворять условию:

д

С = ДЕЛЬТА _ + ДЕЛЬТА _ ,

д л,Х л,Х'

где +/- ДЕЛЬТА _ (+/- ДЕЛЬТА _ ) - характеристика погрешности

л,Х л,Х'

(абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию

компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента

в образце с добавкой соответственно), мг/кг, при этом:

ДЕЛЬТА = +/- 0,84 ДЕЛЬТА,

л

где ДЕЛЬТА - граница абсолютной погрешности, мг/кг;

_

ДЕЛЬТА = дельта х Х / 100,

дельта - граница относительной погрешности методики (показатель

точности в соответствии с диапазоном концентраций, таблица 1), %.

Результат контроля процедуры К рассчитывают по формуле:

к

_ _

К = Х' - Х - С ,

к д

_ _

где Х', Х, С - среднее арифметическое результатов параллельных

д

определений (признанных приемлемыми по п. 11) содержания компонента в

образце с добавкой, испытуемом образце и концентрация добавки

соответственно, мг/кг.

Норматив контроля К рассчитывают по формуле:

______________________

/ 2 2

К = \/ ДЕЛЬТА _ + ДЕЛЬТА _.

л,Х' л,Х

Проводят сопоставление результата контроля процедуры (К ) с нормативом

к

контроля (К).

Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию:

|К | <= К, (2)

к

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При

повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к

неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в

условиях воспроизводимости:

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных

лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):

2 х |Х - Х | х 100

1 2

------------------- <= R, (3)

(Х + Х )

1 2

где:

Х , Х - результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/кг;

1 2

R - предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций,

таблица 1), %.

14. РАЗРАБОТЧИКИ

Российский государственный аграрный университет - МСХА имени К.А. Тимирязева. Учебно-научный консультационный центр "Агроэкология пестицидов и агрохимикатов".