8 Результаты и подготовка отчета
8.1.1 Целью настоящего стандарта является определение влияния исследуемого вещества на результаты репродуктивности. Для каждого испытательного сосуда (т.е. для параллельных испытаний) должно быть вычислено общее число живого потомства на родительскую особь. Кроме того, репродуктивность может быть вычислена на основе продуцирования живого потомства выжившим родительским организмом. Однако наиболее релевантной экологической характеристикой является общее число живого потомства, произведенного на одно родительское животное, которое не погибает случайно или непреднамеренно (см. 2.1.4 и 2.1.5). Если во время испытания родительская особь умирает случайно или непреднамеренно или оказывается самцом, этот сосуд исключают из испытания. В таком случае результаты исследования будут основаны на уменьшенном количестве параллельных испытаний. Если смертность родительской особи происходит в подвергающихся воздействию параллельных испытаниях, следует рассмотреть вопрос о соответствии смертности схеме концентрация - ответ, например, если существует значительная регрессия отклика в зависимости от концентрации исследуемого вещества с положительным наклоном (можно использовать статистический анализ, например тренд-тест Cochran - Armitage). Если смертность не соответствует схеме концентрация - ответ, то параллельные опыты со смертностью родительской особи исключают из анализа результатов испытания. Если смертность соответствует схеме концентрация - ответ, смертность родительской особи должна быть отнесена к влиянию исследуемого вещества, и параллельный опыт не исключают из анализа результатов испытания.
8.1.2 Таким образом, если для выражения воздействия используют LOEC и NOEC или ECx, рекомендуется вычислять влияние на репродуктивность с использованием обеих переменных отклика, приведенных выше, таких как:
- общее число живого потомства, продуцированного на родительскую особь, которая не погибла случайно или непреднамеренно во время испытания;
- число продуцированного живого потомства на выжившую родительскую особь.
Полученные значения используют затем в качестве конечного результата минимальных значений NOEC и LOEC или ECx, вычисленного с использованием любой из этих двух переменных отклика.
8.1.3 Перед использованием статистического анализа, например дисперсионного анализа ANOVA, сравнение результатов воздействия с контролем по критерию Стьюдента, тестом Даннетта, тестом Уильямса или тестом Джонкира - Терпстры с пошаговым снижением рекомендуется рассмотреть преобразование данных, если это необходимо для удовлетворения требований конкретного статистического метода. В качестве непараметрических альтернатив можно рассмотреть тесты Данна или Манна - Уитни. Для индивидуальных исследуемых веществ вычисляют 95%-ные доверительные интервалы.
8.1.4 Число выживших родительских особей в необработанных контролях является критерием достоверности и должно быть включено в отчет. Также все другие отрицательные эффекты, например аномальное поведение и токсикологически значимые признаки, должны быть приведены в окончательном отчете.
Значения ECx, включая связанные с ними нижние и верхние границы доверительного интервала, вычисляют с использованием соответствующих статистических методов (например, логистической функции или функции Вейбулла, усеченного метода Спирмена - Карбера или простой интерполяции). Для вычисления значений EC10, EC50 или любого другого ECx весь набор данных должен быть подвергнут регрессионному анализу.
8.1.6.1 Если статистический анализ предназначен для определения NOEC/LOEC, используют соответствующие статистические методы в соответствии с <1>. Как правило, побочные эффекты испытуемого вещества по сравнению с контролем исследуют с использованием односторонней проверки гипотез при статистической значимости p <= 0,05.
--------------------------------
<1> См. [4].
8.1.6.2 Нормальное распределение и однородность дисперсии можно проверить соответствующим статистическим методом, например тестом Шапиро - Уилка и тестом Левена соответственно при статистической значимости p <= 0,05. Может быть проведен односторонний анализ ANOVA с последующим использованием критерия множественных сравнений. Многочисленные сравнения (например, тест Даннетта) или тесты понижения тренда (например, тест Уильямса или тест Джонкира - Терпстры с понижением) могут быть использованы для вычисления существования значительных различий (p <= 0,05) между контролями и разными концентрациями исследуемого вещества (рекомендации по выбору метода приведены в документе <2>). В других случаях для определения NOEC и LOEC могут быть использованы непараметрические методы (например, тест Бонферрони-У в соответствии с тренд-тестами Холма или Джонкира - Терпстры).
--------------------------------
<2> См. [7].
8.1.7 Испытание с использованием предельной дозы
8.1.7.1 При проведении испытания с использованием предельной дозы (сравнивают только контроль и одну исследуемую дозу) и при выполнении предварительных условий процедур проведения параметрического испытания (нормальность распределения, однородность) метрические ответы могут быть оценены с использованием t-критерия Стьюдента (t-тест). Если эти требования не выполняются, могут быть использованы испытания с неравной дисперсией (например, тест Уэлча) или непараметрический U-критерий Манна - Уитни.
8.1.7.2 Для определения существенных различий между контролями (контроль испытуемой среды и контроль растворителя или диспергатора) параллельные результаты каждого контроля могут быть проанализированы, как описано для испытаний с предельной дозой. Если результаты этих испытаний не обнаруживают существенных различий, все контроли и параллельные контроли растворителя могут быть объединены. В противном случае все результаты воздействий следует сравнивать с контролем растворителя.
8.2 Отчет о результатах испытаний
Отчет о результатах испытаний включает:
8.2.1 Исследуемое вещество:
- физическая природа и соответствующие физико-химические свойства;
- данные химической идентификации, включая чистоту.
8.2.2 Подопытный вид:
- клон (определен ли генотип), поставщик или источник (если известны) и условия культивирования. Если используют другой вид, а не Daphnia magna, то это необходимо указать и обосновать.
8.2.3 Условия испытаний:
- используемая процедура испытаний (например, полустатическая или динамическая, объем, число Daphnia magna на литр);
- длительность и интенсивность освещения;
- план испытаний (например, число параллельных испытаний для каждой концентрации, число родительских особей на параллельное испытание);
- сведения о среде, используемой для испытания;
- добавленный органический материал (при использовании), в том числе состав, источник, метод приготовления, TOC/COD основного раствора, оценка получающегося в итоге TOC/COD в испытательной среде;
- подробная информация о кормлении, включая количество (в мг C/Daphnia в день) и расписание (например, тип пищи, включая для водорослей наименование вида, и, если известно, штамм, условия культивирования);
- метод приготовления исходного раствора и частота обновления (приводят концентрации растворителя или диспергатора при их использовании).
8.2.4 Результаты:
- результаты любых предварительных исследований стабильности исследуемого вещества;
- номинальные испытуемые концентрации и результаты всех исследований по определению концентрации исследуемого вещества в испытательных сосудах (пример таблиц данных приведен в приложении Г);
- эффективность применяемого метода и предел измерения;
- качество воды в испытательных сосудах (значение pH, температура, концентрация растворенного кислорода, TOC и/или COD и жесткость, при применении) (пример таблицы данных приведен в приложении В);
- полный отчет о жизнеспособном потомстве от каждой родительской особи (пример таблицы данных приведен в приложении В);
- число и дата случаев гибели родительских особей (пример таблицы данных приведен в приложении В);
- коэффициент вариации для контроля результатов репродуктивности (основанный на общем числе жизнеспособного потомства на родительскую особь, дожившую до конца испытания);
- график общего числа живого потомства, произведенного на родительскую особь в каждом параллельном испытании, за исключением родительских особей, случайно или непреднамеренно погибших во время испытания, в зависимости от концентрации исследуемого вещества;
- при необходимости график общего числа живого потомства, произведенного на одну выжившую родительскую особь в каждом параллельном испытании, в зависимости от концентрации исследуемого вещества;
- при возможности указывают LOEC для воспроизводства, включая описание используемых статистических процедур, и указывают размер ожидаемого эффекта, который можно обнаружить (для обеспечения анализа мощности можно выполнить до начала испытания), и NOEC для воспроизводства, информацию о переменной отклика, использованной для вычисления значений LOEC и NOEC (общее число живого потомства на материнскую особь, которая не погибла случайно или непреднамеренно во время испытания, или как общее число живого потомства на выжившую материнскую особь), если целесообразно, также указывают LOEC или NOEC для смертности родительских особей;
- при необходимости указывают воспроизводимость для ECx и доверительные интервалы (например, 90%-ный или 95%-ный) и график подогнанной модели, использованной для ее вычисления, наклон кривой концентрация - отклик и ее стандартную ошибку;
- другие наблюдаемые биологические эффекты или измерения (например, рост родительских особей), включая соответствующее обоснование;
- объяснение любого отклонения от настоящего стандарта.
(обязательное)
- ПОДГОТОВКА СРЕДЫ ЭЛЕНДТ (ELENDT) M7 И M4
- ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОБЩЕГО СОДЕРЖАНИЯ ОРГАНИЧЕСКОГО УГЛЕРОДА (TOC) И ПОСТРОЕНИЕ НОМОГРАММЫ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЕГО СОДЕРЖАНИЯ В КОРМЕ НА ОСНОВЕ ВОДОРОСЛЕЙ
- ПРИМЕР ЗАПИСИ ДАННЫХ ПО ОБНОВЛЕНИЮ СРЕДЫ, РЕЗУЛЬТАТОВ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКОГО МОНИТОРИНГА СРЕДЫ, КОРМЛЕНИЯ, ВОСПРОИЗВОДСТВА И СМЕРТНОСТИ DAPHNIA MAGNA