IV. Проведение испытаний

"МР 1.1.0120-18. 1.1. Общие вопросы. Гигиена, токсикология, санитария. Экспресс-метод токсиколого-гигиенической оценки парфюмерно-косметической продукции с помощью люминесцентного бактериального теста (с применением измерительного прибора-люминометра типа "Биотокс-10"). Методические рекомендации" (утв. Роспотребнадзором 13.02.2018)

IV. Проведение испытаний

4.1. Условия выполнения токсикологических испытаний.

При проведении испытаний в лаборатории должны быть соблюдены следующие условия:

температура воздуха от +18 до 25 °C;

относительная влажность воздуха не более 80%;

атмосферное давление (84 - 106) кПа [(630 - 800 мм рт. ст.)];

частота переменного тока 50 +/- 1 Гц;

напряжение сети 220 +/- 10 В.

4.2. Отбор проб проводится по ГОСТ 29188.0-2014.

4.3. Приготовление экстрактов из образцов ПК продукции:

4.3.1. Из поступивших на испытания образцов одного наименования (не менее двух единиц) составляют объединенную пробу. Опытные образцы готовят путем разбавления испытуемых образцов в модельной среде (дистиллированная вода).

В сосуд помещают необходимое количество пробы ПК продукции, заливают определенным объемом дистиллированной воды и выдерживают (настаивают) в термостате при температуре 37 °C определенное время (продолжительность экстракции).

Соотношение массы (объема) испытуемой продукции и объема модельной среды, а также продолжительность экстракции приведены в таблице 1.

После окончания экстракции полученные экстракты охлаждают до комнатной температуры и отделяют водную фазу фильтрацией или с помощью делительной воронки.

Испытуемые образцы продукции на носителях предварительно измельчают ножницами.

Испытуемые образцы ПК продукции, представляющей собой жиросодержащие средства, порошкообразные и компактные, эмульсии и суспензии, продукцию на носителях, требуют периодического перемешивания в течение времени экстракции.

Для продукции, применение которой согласно аннотации подразумевает смешивание перед применением нескольких компонентов (для окрашивания, осветления, мелирования волос, для химической завивки или распрямления волос, сухие косметические маски и другая аналогичная продукция), готовят испытуемые образцы в зависимости от полученной консистенции готовой композиции.

Средства для ухода за ногтями требуют предварительной подготовки. На предметное стекло (2 см*2 см) ровным слоем наносят исследуемую навеску (1 г) образца и оставляют при комнатной температуре до полного высыхания. Высушенную пробу переносят в сосуд с дистиллированной водой и готовят экстракт в соответствии с 4.3.1.

Таблица 1

Условия приготовления водных экстрактов

в зависимости от вида продукции

N

Вид ПК продукции

Масса или объем образца

Объем дистиллированной воды, мл

Степень разведения

Продолжительность экстракции, мин

1.

Продукция косметическая гигиеническая моющая

1 мл

20

1:20

10

2.

Жиросодержащие косметические средства

0,1 мл или 0,1 г

100

1:1000

60

3.

Продукция косметическая жидкая, не содержащая спирт

0,1 мл или 0,1 г

100

1:1000

60

4.

Гели косметические

0,1 мл или 0,1 г

100

1:1000

60

5.

Продукция декоративной косметики на эмульсионной основе

0,1 мл или 0,1 г

100

1:1000

60

6.

Продукция косметическая для окрашивания, осветления, химической завивки и выпрямления волос

0,1 мл или 0,1 г

100

1:1000

60

7.

Продукция косметическая на носителях

0,1 мл или 0,1 г

100

1:1000

60

8.

Пилинги, скрабы, эксфолианты

0,1 мл или 0,1 г

100

1:1000

60

9.

Интимная косметика

0,1 мл или 0,1 г

100

1:1000

60

10.

Парфюмерная и косметическая спиртосодержащая продукция

1 мл

20

1:20

10

11.

Дезодоранты и депиляторы в аэрозольной упаковке

0,1 мл

100

1:1000

10

12.

Продукция декоративной косметики порошкообразная и компактная, тальк, присыпки, зубные порошки

0,1 г

100

1:1000

10

13.

Кремы косметические для ухода за кожей лица, тела, волосами, ногтями, губами, кожей вокруг глаз

1 г

10

1:10

60

14.

Продукция декоративной косметики на жировосковой основе

1 г

10

1:10

60

15.

Дезодоранты и депиляторы не в аэрозольной упаковке

1 г

10

1:10

60

16.

Средства для маникюра и ухода за ногтями

1 г

20

1:20

60

17.

Мыло туалетное твердое, соли для ванн, сухие средства для ванн

0,1 г

100

1:1000

60

18.

Зубные пасты

1 г

1000

1:1000

60

19.

Средства гигиены полости рта жидкие

1,0 мл

1000

1:1000

10

20.

Средства для домашнего отбеливания зубов

1 г

1000

1:1000

60

Не допускается консервирование проб, предназначенных для исследования на токсичность.

4.4. Подготовка прибора "Биотокс-10" и тест-объекта "Эколюм":

4.4.1. Подготовка прибора "Биотокс-10".

Подготовку прибора "Биотокс-10" проводят в соответствии с инструкцией по эксплуатации.

4.4.2. Регидратация биосенсора "Эколюм".

4.4.2.1. Вскрыть флакон с лиофилизированным препаратом "Эколюм".

4.4.2.2. Добавить 10 мл дистиллированной воды, комнатной температуры для получения суспензии бактериального препарата. Рекомендуется использовать стерилизованную дистиллированную воду, а также несколько раз встряхнуть флакон с суспензией препарата.

Рекомендуется перемешивание рабочей суспензии препарата перед отбором определенных объемов для проведения анализа.

4.4.2.3. Выдержать суспензию в течение 30 мин.

4.4.3. Определение рабочей концентрации биосенсора "Эколюм".

4.4.3.1. Измерить фоновое значение прибора "Биотокс-10" (по инструкции к прибору, при счете 10 сек без кюветы) и записать это значение.

4.5. Проведение измерений:

4.5.1. Добавить 0,1 мл суспензии бактерий из флакона в кювету люминометра. Затем туда же добавить 0,9 мл дистиллированной воды (комнатная температура).

4.5.2. Вставить кювету с биосенсором в люминометр и измерить величину интенсивности биолюминесценции. Свечение рабочей суспензии бактерий должно находиться в интервале, превышающем фоновое значение прибора в 25 - 250 раз. Если величина больше интервала, то следует разбавить суспензию бактерий дистиллированной водой и повторить измерение.

Если биосенсор стал меньше растворяться холодной дистиллированной воде, рекомендуется более энергично его встряхивать и отфильтровать суспензию бактерий через бумажный фильтр.

4.5.3. В стандартном анализе приготовляют контрольный образец путем смешения в кювете от люминометра 0,1 мл рабочей суспензии бактерий и 0,9 мл дистиллированной воды. При приготовлении опытных образцов к 0,1 мл рабочей суспензии бактерий добавляют 0,9 мл пробы ПК продукции различного разведения в соответствии с таблицей 1 методических рекомендаций. Температура дистиллированной воды и образцов должна быть одинаковой. Указать значение температуры.

Измерение токсикологических параметров проводят с помощью прибора "Биотокс-10" в стандартном варианте через 30 мин экспозиции. В экспрессном варианте допустимо проведение анализа через 5 мин.

4.5.4. Контроль погрешности метода токсикологического анализа.

Контроль качества оценки токсичности объектов окружающей среды проводится по определению чувствительности используемых тест-организмов к модельному "эталонному" токсиканту цинку сернокислому 7-водного (ZnSO47H2O). Расчет проводится по содержанию ионов цинка. Диапазон концентраций модельного токсиканта, при действии которого в течение 30 мин интенсивность биолюминесценции ингибируется на 50%, составляет 0,6 - 1,5 мг/л.

Удовлетворительные результаты, полученные при проверке диапазона реагирования люминесцентных бактерий на модельный токсикант, не обеспечивают гарантии адекватного реагирования организмов на другие токсиканты и тем более их смеси, однако регулярно проводимая проверка позволяет выявить ошибки при приготовлении исследуемых смесей и растворов, нарушения, допускаемые в условиях проведения опытов.

Процедура определения диапазона реагирования тест-системы "Эколюм" на модельный токсикант проводится путем действия раствора, содержащего 4,4 мг/л цинка сернокислого при времени инкубации 30 мин с биосенсором. Должно происходить не менее чем 50% ингибирование интенсивности биолюминесценции по сравнению с контролем. В случае если эта величина меньше, то следует проверить точность приготовления исследуемых растворов, условий проведения опытов.

4.6. Математическая обработка результатов измерений:

4.6.1. Результат токсикологического анализа в документах - индекс токсичности, предусматривающих его использование, представляется в виде:

, при P = 0,95

где - среднее арифметическое определений, s - среднеквадратичное отклонение, P - уровень вероятности.

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов трех (или более - до 10) параллельных измерений индекса токсичности. Индекс токсичности T вычисляется по формуле T = 100 x (Iконтр - Iопыт)/Iконтр, где Iконтр и Iопыт соответственно интенсивности биолюминесценции бактерий в контрольной и опытной пробах.

Среднее квадратичное отклонение результатов определений количественного выражения тест-реакции - индекса токсичности вычисляется по формуле:

где xi - i-й результат определений, n - число параллельных определений.

Среднее арифметическое результатов определений количественного выражения тест-реакций вычисляется по формуле:

Все указанные статистические параметры вычисляются измерительным прибором "Биотокс-10" автоматически по команде оператора.