8.1 Условия хроматографического разделения
8.1.1 Масс-спектрометр и хроматограф включают в соответствии с руководством (инструкцией) по эксплуатации и устанавливают параметры рабочих режимов масс-спектрометрического детектирования и хроматографического разделения.
8.1.2 Например, для колонки диаметром 2,1 мм, длиной 150 мм, с обращеннофазным сорбентом C18 с размером частиц не более 5,0 мкм, соблюдают следующие условия хроматографирования:
- температура колонки - 40 °C;
- скорость потока подвижной фазы - 0,25 см3/мин;
- объем вводимой пробы - 20 мм3.
Разделение проводят в режиме градиентного элюирования (приготовление подвижных фаз А и Б по 6.2) в соответствии с таблицей 3.
Таблица 3
Условия градиентного элюирования при регистрации
положительных ионов
Время, мин | Подвижная фаза А, % | Подвижная фаза Б, % |
0,0 | 95 | 5 |
1,0 | 95 | 5 |
20,0 | 5 | 95 |
20,1 | 95 | 5 |
30,0 | 95 | 5 |
8.1.3 Параметры режима ММР при измерении седативных препаратов и адреноблокаторов приведены в таблице 4.
Таблица 4
Параметры воздействия на ионы в режиме ММР с регистрацией
положительных ионов
Аналит | Ион-предшественник, m/z | Ион-продукт, m/z | Время удерживания, мин | Энергия соударений, эВ | Ускоряющее напряжение на выходе из ячейки столкновений, В | |||
Азаперол | 330,3 | 121,1 | 312,2 | 6,87 | 28 | 20 | 12 | 13 |
Пропионилпромазин | 341,3 | 236,2 | 268,2 | 15,75 | 47 | 32 | 11 | 20 |
Галоперидол | 376,2 | 165,1 | 123,2 | 13,90 | 31 | 55 | 11 | 11 |
Азаперон | 328,3 | 121,1 | 165,2 | 8,01 | 25 | 27 | 12 | 11 |
Флуфеназин | 438,2 | 143,2 | 171,2 | 16,85 | 38 | 34 | 9 | 12 |
Каразолол | 299,2 | 116,2 | 222,2 | 11,64 | 27 | 26 | 10 | 10 |
Ацепромазин | 327,2 | 86,0 | 254,3 | 14,6 | 23 | 31 | 14 | 16 |
Ксилазин | 221,1 | 90,0 | 164,1 | 9,93 | 30 | 35 | 11 | 11 |
Трифлупромазин | 353,2 | 58,2 | 280,1 | 16,61 | 68 | 32 | 7 | 13 |
Детомидин | 187,3 | 81,0 | 54,2 | 11,66 | 25 | 51 | 11 | 8 |
Медетомидин | 201,3 | 95,3 | 68,1 | 12,84 | 24 | 45 | 6 | 8 |
Хлорпромазин | 319,2 | 58,0 | 246,1 | 16,15 | 83 | 30 | 11 | 17 |
Меперидин | 248,2 | 103,2 | 220,3 | 11,11 | 50 | 30 | 8 | 14 |
Диазепам | 285,0 | 154,2 | 193,1 | 17,77 | 36 | 46 | 15 | 15 |
Метопролол | 268,2 | 116,2 | 191,2 | 10,49 | 25 | 23 | 18 | 13 |
Ромифидин | 259,4 | 160,0 | 178,0 | 6,00 | 40 | 45 | 9 | 10 |
Промазин | 284,6 | 180,1 | 212,1 | 11,16 | 52 | 30 | 10 | 15 |
Азаперол-Д4 <*> | 334,3 | 153,2 | 6,80 | 37 | 10 | |||
Азаперон-Д4 <*> | 332,3 | 127,2 | 7,94 | 50 | 17 | |||
Каразолол-Д7 <*> | 306,1 | 123,0 | 11,61 | 24 | 10 | |||
<*> Внутренний стандарт. | ||||||||
Примечание - Приведенные выше параметры хроматографического разделения и масс-спектрометрического детектирования могут отличаться в зависимости от используемого оборудования.
Параметры настройки масс-спектрометрического детектора:
- напряжение на распыляющем капилляре (IS) 5500 В при регистрации положительных ионов;
- температура источника 500 °C;
- разрешение квадруполей Q1/Q3 - единичное;
- поток газа для фрагментации (CAD) - 6 кПа.
8.1.4 Контроль чувствительности масс-спектрометра осуществляют введением в инжектор хроматографа 20 мм3 градуировочного раствора G6 (см. 6.3.3). Полученное соотношение сигнал/шум для каждого аналита должно быть не менее 10.
8.2 Построение градуировочной характеристики
Построение и расчет градуировочной характеристики проводят в каждой серии анализов с помощью программного обеспечения хромато-масс-спектрометра.
8.2.1 Проводят измерения не менее четырех матричных градуировочных растворов, приготовленных по 6.3.3, в порядке возрастания их концентраций. Каждый градуировочный раствор измеряют два раза. Определяют значения времени удерживания ион-продуктов аналитов и их внутренних стандартов.
8.2.2 Вычисление площади пика проводят для каждого ион-продукта анализируемых аналитов и их внутренних стандартов. Количественное определение седативных препаратов и адреноблокаторов проводят по одному, наиболее интенсивному ион-продукту. Для подтверждения наличия седативных препаратов и адреноблокаторов рассчитывают отношения площади пика двух ион-продуктов для каждого аналита в градуировочном растворе.
8.2.3 Градуировочную характеристику строят в координатах "отношение площади пика определяемого соединения к площади пика внутреннего стандарта этого соединения" - "отношение концентраций аналита и внутреннего стандарта". При построении градуировочной характеристики используют линейную регрессию вида y = a + bx, при этом коэффициент корреляции должен быть не менее 0,98. Построение градуировочной характеристики проводят при каждой серии измерений заново.
Соответствие аналитов и их внутренних стандартов указано в таблице 1.
8.2.4 Построение линейного градуировочного графика и расчет концентрации седативных препаратов и адреноблокаторов в анализируемых пробах выполняется системой обработки данных в автоматическом режиме.
8.3 ВЭЖХ-МС/МС-анализ
8.3.1 Для измерения содержания седативных препаратов и адреноблокаторов проводят ВЭЖХ-МС/МС-анализ в соответствии с руководством (инструкцией) по эксплуатации применяемого оборудования. Для каждого аналита проводят два параллельных измерения.
8.3.2 Анализ выполняют в виде серии измерений, включающей следующие образцы:
- подвижную фазу А;
- "чистую" пробу;
- градуировочные растворы (см. 6.3.3);
- экстракты анализируемых проб, приготовленных по 7.2.
8.3.3 Определяют и регистрируют на хроматограмме время удерживания пиков двух ион-продуктов каждого аналита, соответствующее времени удерживания, найденному при измерении градуировочных растворов по 8.1.3.