ХАРАКТЕРИСТИКА МОРСКИХ ОДНОКЛЕТОЧНЫХ МИКРОВОДОРОСЛЕЙ

ХАРАКТЕРИСТИКА МОРСКИХ ОДНОКЛЕТОЧНЫХ МИКРОВОДОРОСЛЕЙ

Морские одноклеточные водоросли являются одними из наиболее распространенных организмов водной среды. К ним относятся представители различных систематических групп: диатомовые, перидиниевые, желто-зеленые, зеленые, протококковые. Наиболее представительными в морских водоемах являются диатомовые и перидиниевые, в пресноводных - протококковые водоросли. В силу своих физиологических особенностей одноклеточные водоросли являются наиболее чувствительными к изменениям внешней среды. Короткий цикл развития позволяет проследить на нескольких поколениях действие загрязняющих веществ. Одноклеточные водоросли используются для биотестирования широкого класса веществ (тяжелые металлы, хлор- и фосфорорганические соединения, ПАВ, детергенты), сточных вод различных отраслей народного хозяйства, загрязненных природных вод и грунтов, предназначенных к дампингу.

В водной токсикологии могут быть использованы виды, нашедшие применение в практике марикультуры. Так, из диатомовых водорослей чаще всего используют Thalassiosira pseudonana, Phaeodactylum tricornutum, Sceletonema costatum, различные виды Chaetoceros.

Б.1 Характеристика, условия получения и культивирования морских одноклеточных водорослей

Phaeodactylum tricornutum. Видом, наиболее хорошо поддающимся культивированию в лабораторных условиях, является Phaeodactylum tricornutum Boohl. - супралиторальная пеннатная диатомовая водоросль. Эти водоросли являются одними из наиболее чувствительных к загрязнению. История их культивирования насчитывает 80 лет, но до 60-х годов она была известна под названием Nitzschia closterium f. Minutissima (ницшия). В отечественной марикультуре феодактилум (ницшию) применяют для выкармливания молоди устриц, артемии, коловраток.

Феодактилум имеет несколько морфологических форм: веретеновидную, трехлучевую, крестообразную и овальную. Настоящий кремневый скелет и четко выраженная потребность в кремнии наблюдается только у овальной формы. Переход от одной формы в другую связан с условиями культивирования, но точные условия до конца не ясны. Размеры трехлучевой составляет от 12 до 15 мкм, веретеновидной - от 20 до 30 мкм. Темп деления 2 - 3 раза в сутки.

Выделяют одноклеточные водоросли из природной морской воды. Пробы воды отбирают вдали от берега, затем ее вносят в колбы вместимостью 100 - 300 мл, в которые предварительно налита питательная среда, приготовленная согласно таблице Б.1. Через 10 - 15 дней в большинстве колб водоросли начинают расти. Содержимое колб просматривают и отбирают отличающиеся наиболее интенсивным ростом организмы. В дальнейшем посредством частых пересевов выделяют монокультуры отдельных видов водорослей [2].

Таблица Б.1

Состав питательной среды Гольдберга в модификации Кабановой

Культивирование феодактилум в лабораторных условиях осуществляют в колбах вместимостью 250 - 300 мл при температуре (20 +/- 2) °C и естественном освещении, избегая прямых солнечных лучей, либо при искусственном освещении 2000 лк (лампы дневного света на высоте 60 см от колб) в люминостате. Пересевать культуру водорослей необходимо один раз в 10 дней в простерилизованную колбу со свежей средой. Пересев необходимо осуществлять над пламенем спиртовки.

Морские одноклеточные микроводоросли выращивают на среде Гольдберга в модификации Ю.Г. Кабановой [2, 3]. Для приготовления питательной среды Гольдберга морскую воду отбирают на условно чистом участке, фильтруют через двойной бумажный или мембранный фильтр N 4, дважды стерилизуют, нагревая на водяной бане до 75 °C, и охлаждают до комнатной температуры. В подготовленную таким образом морскую воду последовательно добавляют питательные вещества из четырех заранее приготовленных растворов (см. таблицу Б.1). В морскую воду объемом 1 дм³ вносят 2 см³ раствора N 1, 0,5 см³ раствора N 2 и 1 см³ раствора N 3, затем среду стерилизуют третий раз, охлаждают и только тогда добавляют 1 см³ раствора N 4, чтобы не образовывался осадок гидроокиси железа. Полученный раствор аэрируют.

Вместо природной морской воды можно использовать искусственную морскую воду или водный раствор профессиональный морской соли (Wiegandt, производство Германия).

Dunaliella salina. Зеленая водоросль Dunaliella salina относится к отделу Chlorophyta, классу Volvocophycea, порядку Polyblepharidales. Дуналиелла является важным звеном ряда водных биоценозов. Галобионтные водоросли, в том числе дуналиелла - необходимый элемент питания ракообразных. Род дуналиелла распространен на всех шести континентах Земного шара, включая Антарктиду. Выращивают дуналиеллу в люминостате в 1 - 2 дм³ колбах на основной питательной среде следующего состава [2, 3]: NaCl - 116 г/дм³, MgSO₄·7H₂O - 50 г/дм³, KNO₃ - 2,5 г/дм³, K₂HPO₄ - 0,2 г/дм³ с добавлением раствора микроэлементов.

Для культивирования дуналиеллы используется среда в разбавлении отстоянной дехлорированной водой 1:3. Температура культивирования составляет (24 +/- 2) °C, освещение - 1000 - 2000 лк, продувка CO₂. Культуру фильтруют и обновляют на 1/3 каждые 10 сут. Для сохранения музейной культуры используют агаризованную питательную среду (0,6% агар-агара), после высева ее помещают в люминостат при температуре 5 °C - 6 °C, пересев производят через каждые 2 - 3 месяца.

Для подсчета клеток дуналиеллы их необходимо обездвижить, например, нагревом счетной камеры на спиртовке.

Б.2 Адаптация микроводорослей к солености

Вода отдельных акваторий имеет различную соленость, необходимо иметь культуру водорослей, адаптированную к солености воды, подлежащей биотестированию.

Если соленость исходной природной или искусственной морской воды, на которой готовили питательную среду или культуры водорослей, выше, чем соленость анализируемой пробы воды, тогда указанную исходную воду разбавляют дистиллированной водой до необходимой солености и используют ее для приготовления новой питательной среды.

Если культура водорослей выращивалась на среде с меньшей соленостью, чем соленость анализируемой воды, то готовят новую питательную среду, доведя соленость исходной морской воды до более высокой солености, используя соли, или профессиональную морскую соль (Wiegandl, производство Германия).

К новой питательной среде с пониженной (повышенной) соленостью культуру водорослей адаптируют.

Адаптацию водорослей к среде нужной солености проводят постепенно, меняя соленость питательной среды по следующей схеме [3]. В стерильную колбу вместимостью 250 см³ над пламенем спиртовки наливают 80 см³ исходной культуры водорослей в экспоненциальной фазе роста (в возрасте трех суток), добавляют 20 см³ питательной среды необходимой солености и культивируют при указанных условиях. При этом объем адаптируемой культуры составляет 100 см³. Через каждые 5 сут меняют соотношение адаптируемой культуры и питательной среды в следующих соотношениях: 3:2, 2:3, 1:4 (микроводоросли:питательная среда). Каждый раз культуру водорослей пересевают в новую стерильную колбу на свежую питательную среду с той соленостью, к которой проводят адаптацию. Через 20 дней адаптацию заканчивают. Затем водоросли пересевают на свежую питательную среду, культивируют 5 сут, после чего проверяют пригодность культуры к биотестированию по эталонному токсиканту K₂Cr₂O₇.

Если соленость морской воды отличается от солености питательной среды с культурой водорослей не более, чем на , адаптацию не проводят.

Б.3 Пересев микроводорослей

Культивируя водоросли, периодически обновляют культуру, пересевая ее, на свежую питательную среду не реже одного раза в 10 дней [2, 3]. Для этого в стерильную колбу вместимостью 250 - 300 см³ со свежей средой объемом 150 см³ над пламенем спиртовки приливают 15 - 20 см³ верхнего слоя исходной культуры (содержимое исходной культуры при этом не перемешивают). Начальная плотность клеток в новой колбе составляет примерно 100 - 150 тыс. кл/см³. В случае ослабления интенсивного роста клеток в культуре, корректируют pH.

После посева колбу закрывают стерильной ватно-марлевой пробкой и бумажным колпачком, перемешивают и помещают в люминостат. В процессе культивирования культуру водорослей периодически перемешивают, встряхивая 1 - 2 раза в сутки.

Приложение В

(справочное)